软骨肉瘤是起源于骨组织的一种恶性肿瘤,是第二大常见的骨肿瘤,且对放化疗药物均不敏感。吡咯喹啉醌( PQQ )是一种可溶于水,并且具有较好的热稳定性小分子物质,起初被作为酶的辅因子。 PQQ 与哺乳动物的健康关系密切,可以促进机体生长、生殖,对神经、心血管系统具有很好的保护作用。
最近研究表明, PQQ 具有很好的抗肿瘤作用,对人肺腺癌、肝癌及脑癌等细胞系均具有明显的杀伤作用,且其对正常细胞副作用较小,这使得 PQQ 可能成为肿瘤治疗的理想药物。但 PQQ 对软骨肉瘤是否具有杀伤作用以及 PQQ 抗肿瘤的相关分子机制仍待研究。
为了明确 PQQ 是否具有特异性致使骨肿瘤细胞系死亡作用,我们用不同浓度的 PQQ 处理体外培养的SW1353软骨肉瘤细胞、Saos-2骨肉瘤细胞、WRL68人肝细胞、HEK293人胚肾细胞及XJH B淋巴细胞,检测细胞死亡率。结果发现:肿瘤细胞系死亡率随着 PQQ 浓度的提高而明显增加,当 PQQ 浓度低于120μM时,对正常细胞并无明显毒性。结果证明 PQQ 特异性杀伤软骨肉瘤细胞系SW1353及骨肉瘤细胞系Saos-2。
我们给予体外培养的软骨肉瘤细胞系SW1353以 PQQ 处理,不同时间点去观测细胞死亡率。结果发现:随着时间的增加,肿瘤细胞的死亡率也随之增加。
我们用流式细胞仪,比较分析PBS对照组及 PQQ 处理组骨肿瘤细胞系SW1353和Saos-2的凋亡水平。结果发现: PQQ 处理后,肿瘤细胞凋亡水平明显增加。
这些结果说明 PQQ 通过引起骨肿瘤细胞凋亡来杀伤骨瘤细胞。
先前研究报道, PQQ 通过增加肿瘤氧化应激水平来促进肿瘤细胞凋亡。为了明确 PQQ 处理是否增加骨肉瘤细胞系SW1353氧化应激水平及明确相关分子机制,我们利用流式细胞仪、Western blot及生化检测比较分析了 PBS对照组与 PQQ 处理组氧化应激水平及相关抗氧化分子的的变化,结果显示:较PBS对照组相比, PQQ 处理组细胞活性氧(ROS)及羟自由基(OH.)水平明显升高;还原型谷胱甘肽水平及总SOD活性明显降低,SOD1及SOD2蛋白水平无变化。
我们利用分子对接技术分析 PQQ 与SOD1及SOD2蛋白的可能结合形式,结果发现: PQQ 可与SOD1及SOD2活性中心周围的氨基酸结合分别形成3条及4条氢键,形成稳定结构,表明 PQQ 可能通过封闭SOD1及SOD2蛋白活性中心抑制酶活性。
综上结果, PQQ 通过抑制软骨肉瘤细胞系SW1353中SOD1及SOD2的活性,降低GSH水平以升高氧化应激,诱导细胞凋亡。
为明确 PQQ 引起软骨肉瘤细胞系SW1353的凋亡是否通过线粒体途径,我们利用流式细胞仪、Western blot及蛋白免疫共沉淀技术比较分析PBS对照组及 PQQ 处理组线粒体膜电势及线粒体凋亡途径相关分子的变化,结果显示:较PBS对照组相比, PQQ 处理组线粒体膜电势显著降低;Caspase3前体水平随着 PQQ 浓度的增加而减少,并被Z-VAD所抑制;Smac与XIAP的结合显著增加,而Caspase3与XIAP结合显著减少;线粒中Cytochrome c水平随着 PQQ 浓度的增加而降低,细胞质中Cytochrome c水平随着 PQQ 浓度的增加而增加;线粒中AIF及EndoG的水平随着 PQQ 浓度的增加而减少,细胞核中AIF及EndoG的水平随着 PQQ 浓度的增加而增加。上述结果说明 PQQ 通过激活线粒体凋亡途径,诱导软骨肉瘤细胞系SW1353的凋亡。
为明确TNFα能否促进 PQQ 引起的软骨肉瘤细胞系SW1353的凋亡,我们检测了PBS、 PQQ 、TNFα以及 PQQ 和TNFα共同处理组细胞死亡比例、细胞形态以及凋亡水平,结果发现:较 PQQ 单独处理组相比,TNFα与 PQQ 共同处理组肿瘤细胞死亡率显著增加,细胞骨架破坏及细胞核浓缩更加严重,细胞凋亡水平明显增加。
上述结果说明TNFα显著促进 PQQ 引起的软骨肉瘤细胞系SW1353的凋亡。为明确TNFα促进 PQQ 引起的软骨肉瘤细胞系SW1353的凋亡作用是否与 PQQ 抑制TNFα引起的p65入核相关,我们利用Western blot方法检测TNFα联用不同浓度的 PQQ 后,p65蛋白水平变化,结果发现:胞核中p65的蛋白水平随着 PQQ 浓度的增加而逐渐增加,而胞浆中p65的蛋白水平随着 PQQ 浓度的增加而逐渐减少。这一结果说明 PQQ 抑制TNFα引起的p65入核。
为了验证 PQQ 对TNFα引起的p65入核的抑制是否引起JNK的持续活化。我们利用In-cell Western检测了TNFα联用 PQQ 后,不同时间点的JNK与磷酸化JNK的水平,结果发现:TNFα单独处理组中,当TNFα处理10分钟后出现JNK的磷酸化,之后JNK磷酸化被抑制;而在TNFα与 PQQ 共同处理组中,JNK出现了持续的磷酸化。这一结果说明, PQQ 联用TNFα促进了JNK的持续磷酸化。
上述结果说明, PQQ 通过抑制TNFα引起的p65入核促进细胞凋亡,至少部分是经过JNK持续磷酸化介导的。为明确 PQQ 是否能够抑制移植瘤的生长,我们建立移植瘤模型,通过测量以及免疫组化的方法比较分析PBS对照组与 PQQ 处理组瘤体大小、瘤体体积、细胞增殖及细胞凋亡指标,结果发现:与PBS对照组相比, PQQ 处理组移植瘤体积显著减小;细胞增殖核抗原(PCNA)阳性细胞百分比显著降低,Tunnel染色发现凋亡细胞百分比明显增加。
我们比较分析PBS对照组与 PQQ 处理组中移植瘤活性氧水平、DNA损伤相关指标y-H2AX以及胞核p65水平,结果发现:与PBS对照组相比, PQQ 处理组移植瘤活性氧水平明显增加,DNA损伤相关指标γ-H2AX阳性百分比明显增加,细胞核内p65水平降低。
上述结果说明 PQQ 通过抑制移植瘤细胞增殖及促进移植瘤细胞凋亡,而发挥抑制移植瘤生长的作用,这种作用可能通过引起移植瘤细胞氧化应激、DNA损伤增加及细胞核内p65水平降低来实现的。本研究结果证明 PQQ 可以通过抑制软骨肉瘤细胞抗氧化系统,升高氧化应激水平,损伤线粒体以及诱导线粒体凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。此外, PQQ 还能通过抑制TNFα引起的NF-κB入核,促进JNK持续磷酸化进一步诱导细胞凋亡。此研究成果为 PQQ 以及 PQQ 与TNFα联用治疗软骨肉瘤提供实验与理论依据。
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